Este documento proporciona requisitos genéricos para evaluar el rendimiento y garantizar la calidad de los métodos utilizados para la cuantificación de secuencias específicas de ácidos nucleicos (dianas). Este documento es aplicable a la cuantificación de secuencias diana de DNA (ácido desoxirribonucleico) y ARN (ácido ribonucleico) utilizando tecnologías de amplificación digital (dPCR) o cuantitativa en tiempo real (qPCR). Se aplica a las secuencias diana presentes en las moléculas de ácido nucleico, incluido el DNA de doble cadena (dsDNA), como el DNA genómico (gDNA) y el DNA plasmídico, el DNA de cadena simple (ssDNA), el DNA complementario (cDNA) y el ARN monocatenario (sRNA), incluidos el ARN ribosómico (rRNA), el ARN mensajero (mRNA) y los ARN no codificantes largos y cortos [microARNs (miRNAs) y ARN de interferencia corta (siRNA)], así como el ARN bicatenario (dsRNA). Este documento se aplica a los ácidos nucleicos derivados de fuentes biológicas como los virus, las células procariotas y eucariotas, los fluidos biológicos libres de células (por ejemplo, el plasma o los medios celulares) o las fuentes in vitro [por ejemplo, los oligonucleótidos, las construcciones genéticas sintéticas y el ARN transcrito in vitro (IVT)]. Este documento no es aplicable a la cuantificación de oligonucleótidos de DNA muy cortos (<50 bases). Este documento abarca: - Diseño analítico que incluya estrategias de cuantificación (cuantificación del número de copias de ácidos nucleicos mediante una curva de calibración como en la qPCR o mediante recuento molecular como en la dPCR, cuantificación relativa a una muestra independiente y mediciones de proporción) y uso de controles; - Cuantificación de la concentración de masa total de ácido nucleico y control de calidad de una muestra de ácido nucleico, incluyendo la evaluación de la calidad del ácido nucleico (pureza e integridad); - Diseño de ensayos de PCR, optimización, pruebas de especificidad in silico e in vitro; - Control de calidad de los datos y análisis, incluidos los criterios de aceptación, el establecimiento de umbrales y la normalización; - validación de métodos (precisión, linealidad, límite de cuantificación, límite de detección, veracidad y robustez) con requisitos específicos para qPCR y dPCR; - enfoques para establecer la trazabilidad metrológica y estimar la incertidumbre de las mediciones. Este documento no proporciona requisitos ni criterios de aceptación para el muestreo de materiales biológicos o el procesamiento de muestras biológicas (es decir, recolección, conservación, transporte, almacenamiento, tratamiento y extracción de ácidos nucleicos). Tampoco proporciona requisitos y criterios de aceptación para aplicaciones específicas (por ejemplo, aplicaciones alimentarias o clínicas en las que pueden surgir problemas específicos de matriz).